原代 T 细胞分离培养及病毒感染操作手册文件下载

?T?胞分离培养及病毒操作手册

汉恒生物独家研发适用原代T细胞病毒有两种:逆转录病毒(mTRvhRv)和悬浮细胞专用的U赢电竞毒(Ads。其中逆转录病毒感染细胞具有物种特异性,适用小鼠原代T细胞的为mTRv,适用人原代T细胞的为hTRv。逆转录病毒可以用来构建稳转系。专用U赢电竞毒Ads不区分物种,对人、小鼠等物种的原代T细胞均具有很高的感染效率,另外,Ads也非常适用感染其他悬浮细胞,如JurkatK562HL-60L1210等,Ads专用U赢电竞毒不适合用来构建稳转系,详情请参考“汉恒悬浮细胞专用U赢电竞毒操作技术文档”。

. 小鼠脾脏细胞悬液制备

1.?脱颈处死小鼠,腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。

2.?75乙醇消毒,剪开腹部取脾脏。

3.?将脾脏放入预先放置好cell?strainerFALCON352350并已加入5ml?无菌PBS的六孔板或培养皿中。

4.?用无菌注射器柄充分研磨脾脏。

5.?弃掉cell?strainer,轻柔吹打细胞至充分重悬,收集到一无菌15?ml离心管中,4?400g离心5?min

注:一旦取出脾脏,请置于冰上操作

6.?将第5离心后弃上的脾脏细胞用5?ml无菌ACK裂解液轻柔充分吹打混匀,于冰上裂解5?min

注:ACK裂解液配方如,配好之后用0.22?μm膜过滤,4保存不超过1

配制?500 ml 1?ACK buffer

NH?Cl

4.1 g

KHCO3

0.5 g

0.5 M EDTA-2Na

100 ml

7.?裂解结束加入10?ml无菌PBS终止裂解反应,4?400g离心5?min

8.?弃上清,用10?ml无菌PBS,弃上清后直接加入培养基重悬计数一只脾脏可得3-10?107个细胞

注:如果要进行下一步的分离CD4+T细胞操作,请直接按照说明书将细胞重悬在合适体积的PBS中。

. PBMC细胞制备

1.?取一15?ml离心管,加入2?ml已用抗凝剂处理过的血液样品,再加入等体积的PBS进行稀释(终体积4?ml)。

注:若为经过处理的浓缩血液样品,请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率,请使用新鲜血液,血液样品请于18-20℃保存。

2.?上下颠倒或用枪混匀样品,备用。

3.?上下翻转确保Ficoll-Paque?PLUS?(GE)分离液彻底混匀,去掉聚丙烯瓶盖,使用注射器针头插入瓶塞吸取3?ml分离液。

注:分离之前请将Ficoll-Paque?PLUS分离液预热18-20℃。

4.?取一新的无菌15?ml离心管,加入3?ml 步骤3中取出的分离液

5.?小心加入稀释好的4?ml血液样品,不打破Ficoll-Paque?PLUS液面。

注:可将离心管倾斜至与水平台面呈30°,缓慢沿管壁加入血液样品。

4.将离心管小心竖直放入离心机内,于18-20℃,400g离心30-40?min

注:特别注意将离心机的降速加速度调到0

6.?小心取出离心管。此时液体分为3中层为分离液层,最下层为红细胞,最上层为血浆。位于中层靠近血浆层的白膜层即为核细胞层,小心吸走血浆层,不要打动白膜层。

注:可吸出最上层的血浆层保存以备后续使用。

7.?用无菌移液枪将白膜吸到一新的离心管中。

8.?用三倍体积6?ml)的无菌PBS重悬步骤7中的PBMC,重悬时用枪轻柔吹散,于18-20℃,400g离心10-15?min重复一次,最后用培养基重悬备用,多余的PBMC可以冻存继续使用。

特注:在较高的离心速度下(400-500g)可以提高PBMC的得率,同时需注意在较低的离心速度下(60-100g)可以分离掉不需要的血小板。另外如上操作和比例适用于更大体积的分离。

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. CD4+ T 细胞体外刺激

1.?按照小鼠或人源CD4+?T 细胞分离kit?(Thermo)?说明书分离得到CD4+ T 细胞。

2.?取所需体积的PBS,按照5?mg/ml的终浓度加入Anti-mouse CD3eAnti-mouse CD28抗体,500?μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate,室温放置4h,吸掉抗体悬液,加入500?μl 1% BSAPBS配置)室温封闭30?min,封闭结束加入500?μl PBS洗孔一次。

注:请在分离细胞的同时准备好平板,包括后续感染所需的量。

3.将分离得到的CD4+?T按照浓度5?105?cell/ml重悬在完全T细胞培养基中(1640,?10% FBS,?1% penicillin-streptomycin, 50 mM β-mercaptoethanol, 100?U/ml IL-2将细胞加入步骤2中包被处理好的平板,2?ml每孔(1?106?cell/well),然后放入37?CO2培养箱刺激培养48h细胞在刺激24h后体积略微增大,进入活化状态,刺激48h后可进行病毒感染。

.?CD4+?T细胞感染(以过表达GFP的病毒为例)

1. 收集活化好的CD4+?T细胞,400g离心5min。用T细胞培养基重悬计数备用,在收集的过程中发现有些细胞贴壁,此为正常现象,可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。

2. 另取一Anti-mouse CD3eAnti-mouse CD28抗体包被好的24孔板,每孔加入2-5?105的细胞(若为96孔板,加入2?104细胞/孔)若考虑长期表达目的基因,MOI=50-100加入汉恒生物T细胞专用逆转录病毒mTRv-GFP或者hTRv-GFP注意鼠源和人源原代T细胞所适合的逆转录病毒种类差别;若考虑瞬时(一周以内)表达目的基因,可按MOI=500-1000加入汉恒悬浮细胞专用U赢电竞毒Ads-GFP同时加入polybrene至终浓度6?ug/ml,最终感染体积为500?ul,加入病毒后轻轻吹打混匀。

注:具体MOI选择可在96孔板中预实验进行梯度摸索,对于逆转录病毒建议使用1030100的梯度进行,对于U赢电竞毒建议使用50010001500的梯度进行摸索。

3. 24-well plate1000 g 室温离心感染90?min。离心结束后将平板放入37?CO2培养箱感染6?h

注:离心结束观察细胞分散状态,除非细胞全聚集在一处,否则不建议吹散细胞。

4. 感染结束后取出培养板,小心吸掉感染孔中350ul的培养基(70%),加入1.85?mlT细胞完全培养基补足体积为2?ml并吹打混匀。

5.?可选步骤:病毒感染24h后,小心吸掉培养基,在同一培养皿中按照2-4步进行病毒复感染操作

6. 将细胞放入37?CO2培养箱继续培养,2-3天后可观察荧光,做流式检测感染效率。正常情况下,汉恒生物提供的T细胞专用逆转录病毒mTRvhTRv和悬浮细胞专用U赢电竞毒(Ads)感染原代T细胞的效率大于50%

注:感染后刺激的细胞增殖较快,请注意观察细胞密度并使其维持在1?106/ml左右。此外如果需要让细胞增殖较长时间,为了防止其过度活化,可撤掉抗体的刺激。

五. 原代T细胞病毒感染结果(见下)


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Chinese, Simplified
 
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