RNAFit RNA专用转染试剂说明文件下载

介绍:RNAFit是一种功能强大的siRNA / miRNA转染试剂,可确保在哺乳动物细胞中进行有效的转染和基因沉默,并且具有高重复性的结果。在绝大多数的细胞(如HeLa,MCF7或NIH-3T3)中使用RNAFit转染1 nM siRNA,就能达到超过90%的转染效率;对于难以转染的悬浮细胞系如K562或THP-1细胞,使用RNAFit转染终浓度为5 nM的siRNA,也可以观察到超过80%的转染效率。

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1、贴壁细胞转染siRNA操作步骤

1.1接种细胞

为了使用RNAFit转染贴壁细胞取得最佳的转染效果,需要提前一天将细胞接种到相应的培养板中,以转染时细胞汇合度达到30-50%为宜。(推荐接种的细胞数量参见表1)

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表1.转染前一天推荐接种的细胞数

培养板规格

接种细胞数量

?每孔表面积

??培养基体积

96-well

5 000 ± 2 500

0.3cm2

0.2?ml

24-well

25 000 ± 10 000

1.9?cm2

1?ml

12-well

50 000 ± 20 000

3.8?cm2

2?ml

6-well / 3.5 cm

150 000 ± 50 000

9.4?cm2

4?ml

6 cm?培养皿/25cm2培养瓶

400000 ± 100000

25 - 28?cm2

8?ml

10 cm培养皿?/ 75 cm2培养瓶

1 x 106?± 250 000

75 - 78.5?cm2

15?ml

14 cm培养皿?/ 175 cm2培养瓶

2 x 106?- 5 x 106

153 - 175?cm2

20?ml

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1.2 贴壁细胞转染

为了达到高的基因沉默效率,我们建议siRNA浓度范围为1 nM至10 nM,因为最佳siRNA浓度和靶基因本身、细胞类型、siRNA效力、靶mRNA的半衰期等有很大关系。需要注意的是,在较低的siRNA浓度下,脱靶率通常最低。 RNAFit的用量应根据siRNA浓度和培养皿规格进行调整,见表2。

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注意:

1.转染前确认好 siRNA 的大小和纯度。

2.避免 RNase 污染,微量 RNase 就会导致 siRNA 实验失败。需要使用无RNase的耗材及试剂,保证实验每个步骤不受RNase污染非常重要。

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1.2.1转染1nM siRNA的操作步骤

以下步骤用于在24孔板中转染1nM siRNA双链体,如使用其他规格的培养皿进行转染,可参见表2。

1)将0.6 pmoles(8.4 ng)的siRNA双链体稀释到100?μl无血清的培养基中或Opti-MEM中,用移液枪轻轻吹?3~5 次混匀

2)向上述100?μl 含siRNA的培养基中加入2μl?RNAFit。

3)加入RNAFit后立即涡旋振荡10秒钟,进行混匀。

4)在室温下孵育10分钟,使siRNA双链体和RNAFit之间形成转染复合物,不要超过30分钟。

5)在转染复合物形成期间,吸弃培养皿中原有的培养基,并向每孔中重新加入0.5 ml预热的新鲜的完全培养基。

6)将步骤4中的100?μl转染复合物加入?24 孔细胞板中前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的最终体积为600?μl,siRNA终浓度为1nM。

7)细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养

8)转染完成后 24~72 小时均可通过?qPCR?Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测

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表2.1nM siRNA时各种细胞培养容器的推荐转染条件

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培养板规格

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siRNA(pmoles)/孔

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siRNA(ng)/孔

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RNAFit 体积

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无血清培养基体积

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完全培养基体积

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总体积

96-well

0.17

2.4 ng

0.75?± 0.5 ?l

50 ?l

125 ?l

175 ?l

24-well

0.6

8.4 ng

2 ± 1 ?l

100 ?l

500 ?l

600 ?l

12-well

1.2

17 ng

4 ± 2 ?l

200 ?l

1 ml

1.2 ml

6-well /3.5 cm

2.2

31 ng

8 ± 4 ?l

200 ?l

2 ml

2.2 ml

6 cm / 25 cm2培养瓶

4.4

62 ng

15 ± 5 ?l

400 ?l

4 ml

4.4 ml

10 cm / 75 cm2培养瓶

10.5

147 ng

40 ± 10 ?l

500 ?l

10 ml

10.5 ml

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1.2.2转染10nM ~50nM siRNA的操作步骤

?当siRNA浓度范围为10至50 nM时,请使用表3中所示的推荐条件。

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表3.10至50nM siRNA时不同细胞培养容器中转染贴壁细胞的推荐条件

培养板规格

RNAFit体积

无血清培养基体积

完全培养基

体积

总体积

96-well

1 ± 0.5 ?l

50 ?l

125 ?l

175 ?l

24-well

3 ± 1 ?l

100 ?l

500 ?l

600 ?l

12-well

6 ± 2 ?l

200 ?l

1 ml

1.2 ml

6-well / 3.5 cm

12 ± 4 ?l

200 ?l

2 ml

2.2 ml

6 cm / 25 cm2培养瓶

20 ± 5 ?l

400 ?l

4 ml

4.4 ml

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2、悬浮细胞转染siRNA操作步骤

2.1接种细胞

为了使用RNAFit转染悬浮细胞取得最佳的转染效果,与常规培养条件相比,应在转染当天减少培养基体积接种细胞。对于不同规格的培养板,建议接种的细胞数量及完全培养基体积可参见表4。

表4.在转染当天接种的悬浮细胞的数量

培养板规格

接种细胞数量

培养基体积

384-well

5 000 - 10 000

25 ?l

96-well

10 000 - 20 000

50 ?l

24-well

100 000 - 200 000

200 ?l

12-well

200 000 - 400 000

500 ?l

6-well / 3.5 cm

500 000 - 2 x 106

1 ml

6 cm / 25 cm2?培养瓶

2 x 106?- 5 x 106

2 ml

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2.2悬浮细胞转染

为了达到高的基因沉默效率,我们建议对siRNA浓度从5 nM至20 nM范围进行摸索,根据表5中所述的siRNA浓度,需要相应地调整RNAFit的体积。

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表5.根据siRNA浓度和培养板规格推荐使用的RNAFit体积。

??siRNA?终浓度

????培养板规格

???RNAFit体积

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1 to 20 nM

384-well

1 ± 0.5 ?l

96-well

2 ± 1 ?l

24-well

3 ± 2 ?l

6-well or 35 mm

10 ± 8 ?l

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20 to 50 nM

384-well

1.5 ± 0.5 ?l

96-well

3 ± 1 ?l

24-well

5 ± 2 ?l

6-well or 35 mm

15 ± 8 ?l

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以下步骤用于在24孔板中转染5nM siRNA双链体,如使用其他规格的培养皿进行转染,可参见表6。

1)将1.5 pmoles(21 ng)的siRNA双链体稀释到100?μl不含血清的培养基中或Opti-MEM中,移液枪轻轻吹3~5 次混匀

2)向上述100?μl 含siRNA的培养基中加入4μl?RNAFit。

3)立即涡旋振荡10秒钟,进行混匀。

4)在室温下孵育10分钟,使siRNA双链体和RNAFit之间形成转染复合物,不要超过30分钟。

5)将步骤4中的100?μl转染复合物加入?24 孔细胞板中,每孔中细胞悬液为200?μl,前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的最终体积为300?μl,siRNA终浓度为5 nM。

6)细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养

7)转染完成后 24~72 小时均可通过?qPCR?Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测

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表6.悬浮细胞中5nM的siRNA转染的推荐条件

培养板规格

siRNA(pmoles)/孔

siRNA(ng)/孔

RNAFit体积/孔

无血清培养基/孔

细胞悬液体积

4-6小时后加入培养基的体积

384-well

0.25

3.75ng

1 ± 0.5 ?l

25?l

25?l

0?l

96-well

0.5

7.5ng

2?± 1 ?l

50?l

50?l

100?l

24-well

1.5

21ng

3?± 2 ?l

100?l

200?l

0.7ml

12-well

3.5

49ng

6?± 4 ?l

200?l

500?l

1ml

6-well / 3.5 cm

6

84ng

10 ±?8??l

200?l

1ml

2ml

6 cm / 25 cm2培养瓶

12

168ng

15?±?10?l

400?l

2ml

4ml

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3、 miRNA转染

在贴壁细胞中转染miRNA的操作步骤参见1.2;在悬浮细胞中转染miRNA的操作步骤参见2.2。

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4、疑难解答

问题

解决建议

较低的沉默效率

增加每孔中siRNA浓度。

增加每孔中RNAFit的量。

检测转染24h~96h的不同时间点的沉默效率。

用opti-MEM稀释siRNA。

确保贴壁细胞在转染当天汇合度达到30-50%。对于小细胞和生长缓慢的细胞类型,每孔中接种约2倍数量的细胞以达到足够的汇合度。

确认所有试剂是否不含RNase。

确保siRNA是高质量的(PAGE纯化和脱盐)。

确认siRNA双链体的浓度和退火条件。

将转染期间的培养基体积减少一半并低速离心培养板(180g,5分钟)。 4小时后,加入0.5毫升培养基。

细胞毒性

通过在转染后4至6小时更换培养基或简单地向培养基中添加新鲜培养基,减少RNAFit/ siRNA复合物与细胞的孵育时间。

减少转染试验中使用的RNAFit的体积。

核实沉默靶基因后是否不影响细胞活力。

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Chinese, Simplified
 
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